興奮劑促紅細(xì)胞生成素免疫檢測方法的研究

　　本研究成功地制備了兩株抗重組EPO(rHuEPO)的單克隆抗體，建立了檢測血清中EPO含量的競爭酶聯(lián)免疫吸附方法；同時，把從鈍頂螺旋藻中提取純化的藻膽蛋白作為熒光標(biāo)記物，標(biāo)記單克隆抗體，建立了檢測血清中EPO含量的熒光免疫法。經(jīng)與酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)比較，無顯著差異。本研究首次用熒光探針藻膽蛋白(PBP)標(biāo)記檢測EPO，建立了可用于體育藥檢的特異的檢測方法。這對興奮劑EPO的檢測具有重要的意義。

1.1　材料

　　rHuEPO(中日友好醫(yī)院惠贈)，抗rHuEPO雜交瘤細(xì)胞株、鈍頂螺旋藻由北京大學(xué)生命中心單克隆抗體實(shí)驗(yàn)室提供，BALB/c小鼠、昆明小鼠購自流行病研究所。DEAE-SepharoseFastFlow、Phenyl-sepharoseCL-4B, ProteinASuperoseFastFlow、sephacrylS-200HR、SephacrylS-300HR均為Pharmacia產(chǎn)品。其余試劑為Sigma產(chǎn)品或國產(chǎn)分析純試劑。
1.2　方法

1.2.1　抗人促紅細(xì)胞生成素單克隆抗體的制備
　　復(fù)蘇抗rHuFPO雜交瘤細(xì)胞，采用動物體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法，大量制備腹水。用快速蛋白液相分析儀(FPLC)，聯(lián)合使用疏水柱(Phenyl-SepharoseCL-4B)和ProteinASuperoseFastFlow柱純化單克隆抗體。

1.2.2　單克隆抗體理化性質(zhì)及親和力的鑒定
　　采用雙向免疫擴(kuò)散法、紫外分光光度計(jì)法和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分別測定單克隆抗體的免疫球蛋白類別及亞類、濃度和分子量。參照Beatty等人所建立的方法，尋求抗體與固定化抗原親和常數(shù)。確定抗體的工作濃度，并以此濃度，按照Friguet的方法選擇最合適的抗原包被量。作OD450nm與對數(shù)抗原稀釋度的關(guān)系曲線，求得液相親和常數(shù)。

1.2.3　藻膽蛋白的制備、純化及性質(zhì)測定
　　培養(yǎng)鈍頂螺旋藻，收集的鮮藻泥通過硫酸銨分級分離法得到藻膽蛋白的粗品。聯(lián)合使用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱和SephacrylS-200HR柱進(jìn)一步純化藻膽蛋白，得到的純品進(jìn)行分子量測定，并測定藻膽蛋白的激發(fā)和發(fā)射光譜。

1.2.4　單克隆抗體?藻膽蛋白熒光探針的制備
　　5mgPBP和5μgSPDP依洪孝莊等人的方法進(jìn)行偶聯(lián)，制備單抗-藻膽蛋白的偶聯(lián)物。

1.2.5　競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測方法
　　檢測血清EPO的含量以測定抗體與溶液中抗原的親和常數(shù)時所用抗體濃度作為抗體的工作濃度，并以其所用抗原包被量包被酶標(biāo)板。將含一定量rHuEPO的標(biāo)準(zhǔn)溶液按倍比稀釋與定量McAb溶液分別混合，室溫下溫育15min后加入以rHuEPO包被的酶標(biāo)板中，以EPO稀釋倍數(shù)的對數(shù)(以2為底)為橫坐標(biāo)，OD450nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將正常人血清100μ1與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時同樣量McAb混合，室溫下溫育15min后加入與建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時同樣量rHuEPO包被的酶標(biāo)板中，同上操作，所測數(shù)據(jù)即為血清中EPO含量的OD值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到血清中的EPO含量。

1.2.6熒光免疫法檢測血清中EPO的含量
　　用McAb包被酶標(biāo)板，4℃冰箱過夜后0.01MPBS-PBP探針的混合物(此混合物已在4℃過夜)37℃下保溫1h，酶標(biāo)板用PBS-T洗滌(3×3min)，加入熒光洗脫液100μ1/孔，50℃下溫育30min。同一樣品做5孔。收集相同5孔內(nèi)的液體，HITACHIF-4500熒光分光光度計(jì)測熒光最大發(fā)射峰值對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。用McAb包被，4℃冰箱過夜后0.01MPBS-T洗3次，每孔加入50μl正常人血清樣品與過量IgG-PBP探針的混合物(此混合物已在4℃過夜)，以下操作同上，熒光分光光度計(jì)測熒光最大發(fā)射峰值對應(yīng)的熒光強(qiáng)度后，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到血清中的EPO含量。

2.1　單克隆抗體的性質(zhì)
　　我們得到了穩(wěn)定分泌抗rHuEPO單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別為McAbF8,McAbF11。經(jīng)瓊脂雙向免疫擴(kuò)散法鑒定，McAbF8的亞類為IgG1，McAbF11的亞類為IgG2b。

　　分子量均為147kD。McAbF8與固定化rHuEPO的親和常數(shù)為2.3×106M^-1。

　　按照1.2.2所述方法，測得在抗原包被量為每孔0.02μg時，OD450nm與一抗?jié)舛瘸烧�比，且酶�?biāo)板上抗原對抗體的吸附量小于10％。

　　測得APC兩個亞基具有相同的分子量，均為23.5kD。APC分子量為47kD。APC的激發(fā)和發(fā)射光譜采用HITACHI－F4500熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測定，確定最佳激發(fā)波長為575nm，最佳發(fā)射波長為662nm。

2.3　單克隆抗體-藻膽蛋白熒光探針的制備
　　依1.2.4所述方法制得McAb-APC偶聯(lián)物。其中洗脫緩沖液為0.1mol/L的PBS(pH7.5)，流速0.25ml/min。峰a為Ig-APC偶合物，峰b為未標(biāo)記的McAb和APC。

2.4競爭ELISA法檢測血清EPO含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
　　測得在抗原包被量為每孔EPO0.2μg，McAbF8含量為1.0×10^-10M時，OD450nm與一抗?jié)舛瘸烧�比。由于所選用的抗體工作濃度在圖1所示的線性范圍內(nèi)，所以當(dāng)加入競爭抗原后相對于不加競爭抗原的對照孔所降低的OD值(△OD)與競爭抗原所結(jié)合掉的抗體量成正比，所以可以用降低的OD值(△OD)與對照孔吸收值OD0之比代表被結(jié)合的抗體量與總抗體量之比。

　　OD和OD0分別表示加有競爭抗原和不加競爭抗原時的吸收值，OD代表加入競爭抗原后光吸收值的變化，[Ab]為與競爭抗原結(jié)合的抗體濃度，[Ab]0是抗體的總濃度。其中[Ag]0=7.4×10^-10M2.5熒光免疫法檢測血清EPO含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定按1.2.6的方法，以相對熒光強(qiáng)度對EPO稀釋倍數(shù)的對數(shù)作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6　競爭ELISA法與熒光免疫法測定血清EPO含量對比
　　分別對20例正常人血清用以上兩種方法進(jìn)行測定。

　　興奮劑檢測作為反興奮劑的手段已成為各大賽事中必不可少的一項(xiàng)內(nèi)容。EPO是國際奧委會禁用的肽類激素的一種，國際上還沒有制定出EPO的檢測方法，但精確檢測EPO濃度是確定其檢測標(biāo)準(zhǔn)的首要條件。以單克隆抗體(McAb)為基礎(chǔ)的免疫化學(xué)檢測方法由于具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，方便、快速等特點(diǎn)，成為EPO最具潛力的檢測方法。

　　近年來，藻熒光蛋白作為一種新型探針逐漸受到人們的重視，為檢測提供新的有效途徑。藻膽蛋白在鈍頂螺旋藻中的含量非常豐富，可以占到總蛋白含量的70％以上，這為它的大量純化創(chuàng)造了便利條件。PBP的水溶性好，多次凍融仍能保持其蛋白活性。PBP的表面又具有多種表面功能基因，易于偶聯(lián)到多種小分子和大分子蛋白質(zhì)上，為其作為探針的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。作為一種熒光探針，藻膽蛋白具有其它物質(zhì)難以比擬的優(yōu)點(diǎn)，以APC為例，其STOKES遷移達(dá)到87mm，激發(fā)波長位于可見光區(qū)，摩爾吸光系數(shù)為10⁶數(shù)量級，熒光產(chǎn)率高，且聯(lián)結(jié)于抗體或抗原時不損害它們的活性，完全符合檢測血清樣品的要求，尤其廣泛應(yīng)用的是單克隆抗體和PBP形成的熒光探針，它利用單抗純度高，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)來檢測樣本，大大提高了檢測的敏感性和準(zhǔn)確性，日益受到人們的重視。

　　蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)現(xiàn)在已獲得了廣泛的應(yīng)用，它是建立在雙功能試劑應(yīng)用的基礎(chǔ)上。SPDP是一種效果很好的雙功能試劑。

　　表1競爭ELISA與免疫熒光檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

　　注：t=0.02292,P=0.98183,“E”為競爭ELISA的結(jié)果，IF為免疫熒光檢驗(yàn)結(jié)果，在0.05水平上，二者差異無意義。
　　它能在蛋白質(zhì)ε-NH2端添加硫醇基；在DTT存在的情況下，又使硫醇基生成巰基。一種蛋白質(zhì)的硫醇基和另一種蛋白質(zhì)的巰基結(jié)合，從而使兩種蛋白偶聯(lián)。本研究就是通過此原理將IgG與APC偶聯(lián)的。從本實(shí)驗(yàn)的偶聯(lián)圖譜中可以看到：由于偶聯(lián)到IgG上的APC分子數(shù)目不能保持完全一致，因此在應(yīng)用偶聯(lián)物時取圖譜對應(yīng)峰值兩側(cè)很近的一段區(qū)間內(nèi)的IgG-APC作為應(yīng)用物，這樣就保證了偶聯(lián)物分子量的均一。這種偶聯(lián)物可以認(rèn)為是均一的熒光探針，保證了在后面實(shí)驗(yàn)中所用偶聯(lián)物的穩(wěn)定性和一致性。
　　ELISA作為一種比較成熟的方法，已在醫(yī)學(xué)臨床檢測中獲得了廣泛的應(yīng)用，成為替代放射性免法的首選方法。本實(shí)驗(yàn)建立的競爭ELISA法測得正常人血清中EPO含量與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，都在10^-11M的數(shù)量級。熒光免疫檢測技術(shù)由于其自身的特點(diǎn)而成為取代放射免疫檢測的另一種方法。它具有專一性強(qiáng)，靈敏度高，實(shí)用性好等優(yōu)點(diǎn)，已用來檢測含量很低的生物活性物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)選用藻膽蛋白與單克隆抗體偶聯(lián)，利用單克隆抗體的特異性和藻膽蛋白作為熒光探針的優(yōu)越性，建立了可用于血清中EPO濃度檢測的熒光免疫檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為10^-10～10^-12M。檢測時以一種單抗包被，加入血清后，再加入另一種單抗與藻膽蛋的偶聯(lián)物，這樣可以利用雙抗體夾心的原理捕捉到血清中極微量的EPO。經(jīng)與競爭ELISA比較，二者測得血清中的EPO含量無顯著差異，因此可以證明它在EPO的檢測方法上有良好的應(yīng)用前景，但尚有待更深入的研究，取得更多的數(shù)據(jù)，才能真正應(yīng)用到實(shí)際工作中。